从事糖尿病研究的实验离不开胰岛细胞，然而，胰岛分离是组织细胞分离中最困难的，不仅各种动物的胰岛分离方法不同，同一动物胚胎与成年的分离方法也不同，稍有偏差就可能导致“颗粒无收”。本人将做过的各种动物胰岛分离、纯化及胰岛细胞的活率、功能检测方法陆续报告给大家，希望与有兴趣的XDJM相互交流。本人将持续关注本帖，望大家给以支持。大鼠胰岛细胞分离与纯化1.成年雄性SD大鼠，8～10周龄，体重250～300g，10%戊巴比妥钠40mg/kg肌肉注射麻醉。2.固定四肢成仰卧位，胸腹部备皮后常规碘酒、酒精消毒，腹部“个”切口，分层进入腹腔，牵开肠管，显露胰管及胆总管。3.1号丝线于胰管紧靠肠壁处结扎，胆总管内插入4.5-5号头皮针，丝线结扎固定，切开胸腔，破心放血处死，经胆总管内插管逆行注入预冷的0.5mg/ml胶原酶p溶液8～10ml（视个体大小而定），使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺，移入预置6ml Hank,s液的消化瓶中。4.38℃水浴中静止消化10分钟，取出置于冰浴中用眼科镊撕碎胰腺，（消化熟练后可免去此步，直接振摇。此步可了解消化的情况，很容易撕碎的表示已达到消化的要求）。移入消化瓶中振荡15秒使其呈细砂状，加入4℃新生牛血清10ml与4℃Hank,s 液30ml终止消化。5.用不锈钢网（600μm）过滤，细胞悬液用50ml离心管1000 rpm 4℃离心2分钟，弃去上清液，沉淀物加入4℃ Hank,s 液洗涤，同样方法离心洗涤，加冷Hank,s 液重悬后均分到2根15ml离心管内，1000 rpm 4℃离心2分钟，弃去上清液。6.沉淀物加25%Ficoll 4ml混匀，其上依次分别加入23%、20%、11%Ficoll溶液和Hank,s液各2ml，3000rpm，4℃离心20分钟，吸出23%～20%及20%～11%界面的胰岛，用4℃Hank,s液于50ml离心管内离心洗涤2次备用。胶原酶P配制：在D-Hank,s液中加入7.5mmol/L CaCl2、10mmol/L HEPES、0.2%酚红指示剂，用NaON调PH值（7.8）后储存。临用时取上述配制好的溶液按0.5mg/ml加入腺原酶P，0.22um针头滤器过滤除菌后使用。Ficoll400配制：1、Ficoll 100g+Hank,s溶液200ml，完全溶解后加Hank,s至400ml即为25%Ficoll溶液。2、25%Ficoll 92ml+Hank,s 8ml 即为23% Ficoll溶液。3、25%Ficoll 80ml+Hank,s 20ml 即为20% Ficoll溶液。4、25%Ficoll 44ml+Hank,s 56ml 即为11% Ficoll溶液。谢谢dongwp老师的热心帮助和及时有效的回帖。请各位战友在提问前先去翻一下本版的电子书《胰岛分离与纯化技术手册》，避免重复提问，谢谢。>您好，您的方法与我的分离方法基本一致，但是剂量的选择我有点疑问，首先胶原酶选择的是胶原酶P，但是胶原酶P是选用在狗和人的胰岛细胞分离，当然效果不会有很大差别，但是明明厂家生产时已经分了使用的类型，为何选择胶原酶P。 浓度您选择的是0.5mg/mL 我是选择0.75mg 或0.8mg/mL 。滤器选用20目的也就是200微米的吧？但是比他大的胰岛细胞呢？我选择35目，剃度分成写的不明，请问放Hanks是什么时候？我理解的是选用1.10 1.085 1.069 1.037的剃度分成，还有离心速度我是在最高2500rpm，20分钟。谢谢您的阅览。clsun213 wrote:您好，您的方法与我的分离方法基本一致，但是剂量的选择我有点疑问，首先胶原酶选择的是胶原酶P，但是胶原酶P是选用在狗和人的胰岛细胞分离，当然效果不会有很大差别，但是明明厂家生产时已经分了使用的类型，为何选择胶原酶P。 浓度您选择的是0.5mg/mL 我是选择0.75mg 或0.8mg/mL 。滤器选用20目的也就是200微米的吧？但是比他大的胰岛细胞呢？我选择35目，剃度分成写的不明，请问放Hanks是什么时候？我理解的是选用1.10 1.085 1.069 1.037的剃度分成，还有离心速度我是在最高2500rpm，20分钟。谢谢您的阅览。"滤器选用20目的也就是200微米的吧？但是比他大的胰岛细胞呢？"目数越小代表的孔径越大,20目代表840微米,35目代表500微米.谢谢，JJ 给我的建议。我建议楼主，写的再详细一点，这样会激发大家的热情。支持您！！“但是胶原酶P是选用在狗和人的胰岛细胞分离，当然效果不会有很大差别，但是明明厂家生产时已经分了使用的类型，为何选择胶原酶P。”Roche的胶原酶P是用于胰岛分离的，相当于SIGMA的V型，并无种属之分。摘录其说明书片段：Step Action1•Place the pancreas in a petri dish containing 5 ml (rat) or 2 ml (mouse) Krebs-Ringer solution.•Cut the pancreatic tissue into small pieces by using scissors (for approx. 1 min).2. Transfer the Krebs-Ringer solution with the minced tissue into an appropriate glass vial, into which the necessary amount of Collagenase P had been added before [e.g., 1 mg for a mouse pancreas, or 4–5 mg for a rat pancreas (depending on the size of the organ)].3. Incubate the vial at 37°C in a water bath for a certain period of time (typically for about 12 min), with rapid shaking (300 cycles/min).4. Shake the vial by hand (typically 10–60s) until the solution appears homogeneous.5. Add 10 ml Krebs-Ringer solution and shake the solution again.6•Allow the islets to settle for 3 min and remove the supernatant.•Fill the vial again with Krebs-Ringer solution and resuspend.7. Transfer the suspension into a petri dish and pick the isolated pancreatic islets under a stereomicroscope using an Eppendorf pipette.“浓度您选择的是0.5mg/mL 我是选择0.75mg 或0.8mg/mL 。”胶原酶长期保存后效能会下降。另外，我们选用的含钙、偏碱及38℃消化条件使酶的活性提高，所以采用了0.5mg的浓度。“请问放Hanks是什么时候？”请问放Hanks是过滤后终止消化，因为胶原酶没有特效的拮抗剂，所以终止只能采用稀释和降温。“我理解的是选用1.10 1.085 1.069 1.037的剃度分成，”多数文献报道的都以百分浓度表示，分别是25、23、20、11%，我们测量的结果约为1.088、1.076、1.066、1.040左右。你的比重是用于成人胰岛分离（29、24、21、11%）。沉淀加25％Ficoll适量混匀，依次加入23%， 20%，11%Ficoll溶液和Hanks液楼主上述的Hanks液？我理解是配Ficoll时放Hanks的意思。关于Ficoll不知您选用的是哪个厂家，但是据我经验粉剂的没有液剂的好，成人胰岛分离（29、24、21、11%）请问楼主您主张成人胰岛细胞需要这样的剃度？ 当然本人对人的胰岛细胞分离不清楚，但这方面我看过相关的文献，这是用在什么时候？在哪个步骤？相信很多人关心这方面，相关的文献出处。在Ficoll的最上层（11%）上加Hanks液，增加了11%的上界面，此层无胰岛，但可验证实验状况，当消化过度时，该层有大量被破坏的胰岛。成人胰岛分离（29、24、21、11%）是早年用于成人胰岛分离的方法，国外有很多文献报道，Roche的Liberase HI的说明书也介绍用1.100、1.080、1.060、1.040分离成人胰岛，其所述的比重接近上述的百分比浓度，由于现在的成人胰岛分离已采用COBE 2991细胞淘洗机，故大多用连续密度梯度分离。简述成人胰腺消化、胰岛分离方法：尸体胰腺原位灌洗后置UW液中，4℃保存运输。到实验室后在4℃ Euro-Collins液中清除非胰组织，从胰管内插入穿刺针，丝线缝扎后用注射器灌注Liberase酶溶液（1.5 mg/ml）。胰腺充分膨胀后将胰腺切片，置消化罐中并放入数颗玻璃珠，加500μm孔径的不锈钢丝网，旋紧罐盖。开启蠕动泵将剩余的Liberase酶溶液泵入罐内，控制罐内温度37℃，手动振摇消化罐循环消化，于10分钟后开始取样镜检，待大部分胰岛分离后用冷的含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养液降温稀释终止消化。收集消化物用10% FBS 1640离心洗涤，将消化物混悬于150 ml UW液中，4℃冰浴30分钟。加载1.100Ficoll到COBE 2991细胞掏洗机，从COBE排除空气，启动COBE 旋转2 400 rpm，分别加1.100和1.077的Ficoll到梯度形成仪，将混合形成的连续梯度液泵入COBE，再泵入含组织UW液，最后泵入Hanks液，让COBE 在2 400 rpm转5分钟后分管收集纯化后的组织，镜检各管，将含有胰岛的各管组织合并，用10% FBS 1640离心洗涤两次，取样做胰岛鉴定和计数。在Ficoll的最上层（11%）上加Hanks液，增加了11%的上界面，此层无胰岛，但可验证实验状况，当消化过度时，该层有大量被破坏的胰岛。那么您是用了5个层面，请问消化过渡时说在1.040和hanks之间的平面出粉碎的胰岛细胞，那么这时在1.066和1.040之间是怎么个情况？最上层出现胰岛细胞只是在消化过渡时吗？这方法比较新颖。在1.066和1.040之间是碎的胰岛，但胰岛细胞是活的，可以培养。11%的上界面，此层大量被破坏的胰岛是胰岛的外壳，没有胰岛细胞。虽然不是做这个方面工作的，但是觉得这个帖子非常好，支持dongwp战友。我想过你的ficoll的配方，但是您说出的％和密度不对，您的％和密度有文献依据吗？您的Ficoll的配方中不知您是没有全说还是没有这么做，我认为您的Ficoll的配方中缺FBS或NCS的加入，并且您是用Hanks液是否指的是含10％NCS的Hanks？NCS的浓度是多少，因为觉得您直接用这溶液不会保证每个剃度的NCS含量，如果这样浓度高，您在与细胞混匀时会出现气泡层，如果不想出气泡层就不能充分的快速的混匀。不知您怎么处理这种情况。clsun213：很高兴你对此贴的关注，你的实验方法好象与我们的有些不同，不知你们的方法和效果如何？现将我们的方法祥述如下：一、试剂1. 胶原酶配制：D-Hanks液500ml+7.5mmol/L氯化钙+10mmol/LHEPES，NaOH调pH 7.8，4℃保存。临用时称取胶原酶用此液溶解后0.22u孔径滤膜过滤。2. Ficoll配制：称取Ficoll 100g，加250ml Hanks液（不含CaCl、NaHCO），待全部溶解后用上述Hanks液定容到400ml，此为25% Ficoll；充分混匀后取91ml用上述Hanks液定容到100ml此为23% Ficoll；取80ml用上述Hanks液定容到100ml此为20% Ficoll；取44ml用上述Hanks液定容到100ml此为11% Ficoll。全部配制完成后高压或煮沸灭菌后4℃保存。二、胰腺消化成年大鼠，戊巴比妥钠30mg/kg后肢肌肉注射麻醉，仰卧位，四肢固定，胸腹部备皮后常规碘酒、酒精消毒，腹部“个”切口，分层进入腹腔，牵开肠管，显露胰管及胆总管，4号丝线于胰管紧靠肠壁处结扎，切开胸腔，破心放血处死，胆总管近肠端用丝线结扎，4号半头皮针穿刺，丝线结扎固定针头，用10ml注射器注入预温的0.5mg/ml胶原酶P溶液8ml（含7.5mmol/L Ca++，10mmol/L HEPES，PH7.8），分离已膨胀的胰腺，放入30ml的锥型烧瓶（或25cm培养瓶）中，加Hanks液6ml，加盖后38℃水浴静止消化10分钟，取出振摇，使呈细沙状，20目不锈钢丝网过筛后移入50ml离心管，加入冰冷的Hanks液（含10％新生牛血清NCS），终止消化， 1000rpm 4℃离心3分钟，弃上清，同法洗二次，最后一次移入10ml离心管，弃上清后吸干管口水滴。三、胰岛纯化沉淀加25％Ficoll 4ml混匀，依次小心加入23%， 20%，11%Ficoll溶液2ml和Hanks液，3000rpm 4℃离心20分钟，吸出23%和20%上界面的胰岛，Hanks液洗三次，备用。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=253 height=235 title="Click to view full 未标题.jpg (253 X 235)" border=0 align=absmiddle>您的Ficoll的配方中没有加FBS，我建议您加FBS，理论上而言，也需要使它尽量接近细胞培液环境，不是吗？我们大鼠分离结果还可以，做小鼠肾被膜移植基本能保证一对一。当然也有实验室分得更好，但是其细胞功能及降糖效果比较理想。关于您胶原酶要预热不知是为了避免细胞过受刺激，胶原酶在常温也不是失效吗？您的方法很像我们的方法只不过Ficoll的配方，还有我们是消化期间放入DMEM 不是Hanks。我们在Ficoll的配方中是保持各个剃度液的FBS浓度2％。谢谢您的阅览。胰岛鉴定方法：DTZ染色检测胰岛的纯度；AO－PI染色检测胰岛的活率。附图1. 胰岛DTZ染色：DTZ为螯合指示剂，可与铅，铜，锌等螯合，人和动物（豚鼠除外）的胰岛Ｂ细胞因含锌，DTZ染色呈猩红色，其它胰岛细胞不着色，故DTZ对胰岛呈特异性染色。⑴．无水乙醇配制：DTZ 10mg溶于3ml无水乙醇(含50ul浓NHOH) ，加Hanks液12ml，此为储存液，临用时用Hanks液（PH7.8）1:100稀释，0.22u孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温10分钟后，镜检。（染色对细胞无明显影响，可继续培养）⑵．DMSO配制：DTZ 10mg溶于10ml DMSO，用Hanks液(PH7.8) 1:1000稀释，0.22u孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温10分钟后镜检 。2. 胰岛AO－PI染色：AO为浸润性染料（膜通透性），可侵入活细胞与双链DNA结合发出绿色荧光、与单链DNA（变性DNA）结合发出红色荧光；PI为排斥性染料（膜不通透性），不能进入活细胞，与死亡或正在死亡（膜通透性改变）的细胞的核酸结合，发出红色荧光。溶液配制：用Dulbeccos液配制储存液，AO : 670umol/L，PI：750umol/L，4℃暗处保存，临用前取0.01ml AO与1ml PI混合，用Dulbeccos液10倍稀释，0.22u孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合10分钟，在荧光显微镜下用490 nm激发光滤光片，510nm光栅滤光片可同时见到绿色（AO）和红色（PI）荧光。注：可用Hanks液取代Dulbeccos液。 （缩略图，点击图片链接看原图）dongwp您好，我以前看过您的糖尿病老鼠模型制作的方法，我用裸鼠做糖尿病模型时用60mg/kg计算，分3次注射STZ的方法，C57B/6小鼠是用200mg/kg计算一次成模的方法，基本在80％，我最近发现昆明小鼠好像不适合这个剂量，要是有这方面资料能否共享。还有STZ的配法，对柠檬酸钠溶液有无强调PH值，对STZ的药效有影响吗，因为我简单用3次蒸馏水配STZ也做成0了模型。想与您交换意见。还有想告诉其他人DTZ溶在无水乙醇时先放细胞液再放DTZ，DMSO虽也挥发但无此现象，虽然是简单的操作但是如果反了乙醇溶解的DTZ因挥发快成沉淀。谢谢您的阅览。裸鼠和C57B/6小鼠都是纯系小鼠，个体差异很小，昆明小鼠品系较杂，个体差异也大，已经不太适合做实验了，剂量也是200mg/kg，建议还是用其它品系的好，结果稳定。STZ的配法，柠檬酸缓冲液强调PH4.1，对STZ的药效有无影响不是很清楚，但对成模率有很明显的差别，我们曾顾忌酸性对腹膜的刺激太大（大鼠我们用腹腔内注射），但提高pH后成模率明显下降（血糖不高或自然转阴）。“乙醇溶解的DTZ因挥发快成沉淀。”应该不会有此现象，3ml无水乙醇加Hanks液12ml的储备液中乙醇浓度仅20%，再1：100稀释后使用，乙醇浓度已可忽略不计。但储备液长期保存确会发生沉淀，此不是挥发引起，是DTZ变质产生的，须重新配制。关注中，希望高手多多发言。胰岛功能检测：①胰岛素释放试验：胰岛经Hanks液洗涤三次，加低糖无血清1640培养液（含2.7mmol/L葡萄糖），37℃培养2小时，收集培养液测胰岛素含量；再换高糖无血清1640培养液（含16.7mmol/L葡萄糖、10mmol/L茶碱），37℃培养2小时，收集培养液测胰岛素含量。胰岛素释放指数=高糖胰岛素/低糖胰岛素。②胰岛葡萄糖灌流试验：计数100个ICCs，置于含滤膜的微型滤器中，37℃恒速（0.5ml/分）灌流，先用低糖Krebs液（2.8mmol/L葡萄糖）一小时， 换高糖Krebs液（16.7mmol/L葡萄糖加10mmol/L茶碱）一小时；再用低糖Krebs液灌流，每隔2分钟收集灌流液，检测胰岛素含量，绘制胰岛素分泌动态图。ficoll和hanks液配制即可，分为25%，23，20，11% 上面加hanks,梯度离心即可，1500转/分，10分钟就可以了，胰岛集中在20-23层，有时11-20层也会有少许，回收就是了，如果胰岛的层面不同，是由于胰岛的消化原因，因为消化过渡会使胰岛变轻，主要是结构改变了，所以最关键是消化问题，消化合适的胰岛结构良好，外膜相对完整，消化过渡会外膜破碎，胰岛松散，先写这么多，欢迎讨论，来信[email protected]"消化过渡会使胰岛变轻"消化过渡由于破坏了胰岛的外层纤维膜（V型胶原酶特异性作用于此膜），使胰岛体积松散，导致比重下降。同理，如果消化不足，胰岛没有与腺泡细胞完全分离，就会和腺泡一起沉底。人胎胰岛冷冻保存方法：冻存：人胎胰岛加含10％DMSO的1640培养液，4℃平衡20分钟（使DMSO进入细胞内）用生物降温仪快速降温至0℃，保持20分钟（促使形成小的冰晶），以0.3℃/ 分降温至－80℃，直接投入液氮内冻存。复温：从液氮中取出后直接投入40℃水浴，并轻轻摇动，待溶解后立即移入50ml离心管中，于冰浴中加等量Hanks液，5分钟后再加1倍的Hanks液，……，如此倍比稀释后1000 rpm 4℃ 离心5分钟，加完全培养液重悬再洗一次后培养。近来我开始作胰岛细胞移植的试验，但是在做胰岛细胞提取过程两次后均未能得到胰岛细胞。看了上面的讨论，感觉到受益良多。但有些关键问题仍未能明了，既然各位战友在这里热烈讨论，我也顾不上面子想向大家请教几个很简单的问题。希望大家不吝赐教！先谢谢了！ 问题:1、我用的是胶原酶v，浓度为1mg/ml,水浴箱温度为37度，这都是按照文献上的数据，而且我用的消化时间是30－40分钟.这个时间是7月份参观一位战友做小鼠胰岛细胞移植时自定的，与文献中15分钟的消化时相差太大。而且在我消化完了后检查胰腺组织也未能呈颗粒状。而如dongwp 所说所用胶原酶P的浓度为0.5mg/ml，是不是相当于胶原酶V0.5mg/ml?，而且消化时间是10分钟!两者相比较我的消化时间是不是太长了？是不是是这个原因我没能得到我 想要的结果！而且我的水裕箱没有振荡功能，只能中途用手甩，手甩的力度及次数也没有能掌握！我这里唯一能确定的是大鼠胰腺组织的原位灌注及组织的膨胀没有问题。dongwp兄所说的"振摇”频率到底是多少？恳请赐教！ 问题2、dongwp兄用的不锈钢过滤网是20目，我用的是100目，是不是我的过滤网直径太小，胰岛细胞不能充分过滤下去？原来我曾参观的那位战友所用过滤网为消毒的纱布，我在这里想请教的是这纱布的直径相当于多少目？ 问题3、可不可以用D-HANK液来配置FICOLL粉。这对纯化胰岛细胞有影响吗？既然众多材料说胶原酶需用D-HANKS液来配置。为啥dongwp所用的胶原酶内又添加含7.5mmol/L Ca++，10mmol/L HEPES，PH7.8,这里有无矛盾之处？ 感谢各位在这里开坛立贴、授业解惑！做科研最重要的是要讨论，要交流！这样才会避免走很多弯路.我对此深有体会。恳请大家尽快解答我的问题，现在都11月份了，而明年就要毕业。现在的心情犹如热锅上的蚂蚁！望大家能给我满意的答复，我老板还随时在敲打着我呢！在dongwp 如前所述方法的指导下，今天我又做了一遍胰岛细胞分离、提取、纯化、梯度离心整个步骤。这已是第三遍了，但是依然没有取得好的结果 ！我今天把我的整个实验步骤及实验中的部分数据、照片列出来，通过数据及照片的分析，找出导致错误的原因，并帮助我改正错误，尽快的回到实验的正确轨道上来。方法:今天大鼠的胆总管胰酶原位灌注及胰腺切取很顺利，所用消化酶浓度为1mg/ml，用量为6ml/只。耗时不超过5分钟（两只大鼠），完毕后即置入50ml的离心管中。再将其置入37度的水浴箱中消化。因水浴箱比较古董，没有振荡功能。在按照downwp的消化时间10分钟后取出，胰腺组织并没有呈颗粒状，依然有大块的组织。故认为消化时间不够，又将消化时间延长了10分钟！取出后振摇。此时的组织差不多已呈颗粒状了。在加入4度的hanks液约10ml后用100目的金属不锈钢过虑网过虑，再加入DTZ数滴染色室温下静置10分钟镜检。图片如下我几乎没有看到染成红色的细胞。镜下视野内的细胞大都如下,请问正常的胰岛细胞是这样的吗？如果是的话，那有没有消化过度？ （缩略图，点击图片链接看原图）这是镜下唯一能见到红染的细胞，好像还带有外分泌组织。我在这里想请教大家的是我的DTZ是否配置有误？ （缩略图，点击图片链接看原图）这一张也是的 ，请问大家红染的细胞是否为胰岛细胞？旁边未红染的呢？ （缩略图，点击图片链接看原图）以后的程序我都是依照dongwp操作完成的，最后的结果就是没有见到有明显的分层，也未能见到分层中有所谓的细胞！过程是艰辛的，结果是苦涩、令人沮丧！这就是实验研究！请大家可怜可怜我，尽快施以援手。拜托了！期待ing～～～～～～～yangjhdoctor：很同情你艰辛的劳动却得到苦涩的结果，先谈谈你的照片，再与你讨论原因。1.先明确DTZ染色是与胰岛素的锌离子螯合，前两张照片可见到在细胞间隙有红染，表明有胰岛细胞破坏导致胰岛素外漏。2.最后一张照片红染的是胰岛，因看不清楚结构，无法判断细胞是否成活（DTZ染色不能鉴别胰岛细胞的死活）。根据你的消化方法：“所用消化酶浓度为1mg/ml，用量为6ml/只。耗时不超过5分钟（两只大鼠），完毕后即置入50ml的离心管中。再将其置入37度的水浴箱中消化。因水浴箱比较古董，没有振荡功能。在按照downwp的消化时间10分钟后取出，胰腺组织并没有呈颗粒状，依然有大块的组织。故认为消化时间不够，又将消化时间延长了10分钟！取出后振摇。此时的组织差不多已呈颗粒状了。”我们是“38℃水浴静止消化10分钟，取出振摇，使呈细沙状”。是振摇后呈细沙状，在摇前是完整的。“在加入4度的hanks液约10ml后用100目的金属不锈钢过虑网过虑，再加入DTZ数滴染色室温下静置10分钟镜检。”终止消化需用蛋白，我们是预加数毫升小牛血清于过滤的容器中，滤完后加冷Hanks液。理论上100目的金属不锈钢过虑网孔径太小，胰岛无法滤过（大的胰岛有500um），但照片上看到的腺泡碎片也很大，不知何故。从照片看：1.有很多血细胞，是没有放血还是放血不干净？血清会影响酶的消化。2.消化有胶状物产生，会影响胰岛的纯化结果。3.胰岛有破坏，消化后胰岛的得率就不高。建议：如果是按我们的方法做，必须完全一致，从酶的配制（含钙、偏碱）、消化温度（38℃）等，相信一定会得到完美的结果。感谢dongwp 及时回复。这对我来说犹如漆黑的夜里出现了一缕亮光！诚如dongwp 所说：大鼠的处死方法是颈椎脱臼，没有剪破心脏放血！两只大鼠过滤的器具分别采用100目的不锈钢过滤网及纱布，目的是想在对照获得过滤得正确方法。但是两只大鼠的胰腺组织消化时间是一样的！以上图片有红染胰岛细胞的那张是用纱布过滤所得。在过滤完后予以DTZ染色，所见如上面图片所示。但在洗涤、纯化胰岛细胞时分别用的是HANKS液及D-HANKS液，因为我的hanks液在加了酚红后也呈红色，我怕与DTZ染色后的标本相混淆！ 在通过这次的实验过程中所能得到的结论就是不能用100目的不锈钢过滤网过滤啦.另外我想请教的是在红染的图片中,在靠图片右边的那些细胞是不是胰岛细胞呢?恳请dongwp 兄再指教!我在这里想提出一个非分的要求:能不能将你的操作程序发给我,我的邮箱是[email protected].先谢谢了！在红染的图片中靠图片右边的那些细胞是腺泡细胞，不是胰岛细胞。操作程序待整理后发给你。谢谢downwp的解惑。我期待你的回复！操作程序已PM你，请查收。祝你实验顺利！！我已经收到你的来信，在你的来信之前我又做了一遍。消化时间是10分钟。当然消化酶的浓度及配置还是原来的！我在振摇了后见块状的胰腺组织，考虑消化时间不够！但我今天的想发是能见到胰岛细胞就可以了。用dtz染色后如下图，这应该是胰岛细胞了吧？ （缩略图，点击图片链接看原图）再次感谢downwp的慷慨相助，啥时有空请你喝酒！哈哈
